Jaké jsou kroky při zpracování vzorku

Průvodce nákupem

DNAmeter odběrové sady se nabízí ve dvou variantách, a to podle typu poskytnutého biologického materiálu:

• Odběrová sada pro analýzu DNA z kapky krve

• Odběrová sada pro analýzu DNA ze slin

Odběrovou sadu si můžete zakoupit různými způsoby, a to na/v:

• DNAmeter e-shopu

• DNAmeter automatu
  DNAmeter automat slouží k výdeji odběrových sad nebo přijmutí biologického vzorku od zákazníka.

Transport

Poté, co odeberete vzorek, je potřeba, ho odevzdat do 48 hodin zpět do automatu nebo kurýrovi. Naše sběromaty jsou vybaveny unikátním systémem, který upozorní kurýry na to, že byl vzorek odevzdán a ti ho v nejbližší možné době vyzvednou.

Jakmile Vaše vzorky obdržíme, začneme s jejich skladováním v lednicích nebo chladicích boxech o teplotě 2 – 8 °C. Náš systém automaticky informuje externí laboratoř o dostupnosti vašeho vzorku. Externí laboratoři, která pro naše zařízení provádí izolaci DNA a její sekvenaci předáváme pouze vzorek a číslo vzorku. Po nashromáždění dostatečného množství vzorků laboratoř zajistí transport z naší pražské pobočky do externí české laboratoře.

Každý vzorek je označen unikátním identifikačním číslem. Protože externí laboratoře používají své interní čísla vzorků existuje mezi naší společností a externí laboratoří předávací párovací dokument, který páruje unikátní identifikační kód z Vašeho vzorku společně s unikátním identifikačním kódem externí laboratoře. Předávací párovací dokument je přiložen k zásilce se vzorky. Kromě tohoto dokumentu provází transport vzorků také přepravní doklad, který udává počet transportovaných vzorků a teplotní podmínky pro transport.

Izolace DNA

Po přijetí vzorků do laboratoře proběhne nejprve izolace DNA. Izolát DNA se následně skladuje v mrazícím zařízení o teplotě - 20°C.

Příprava knihoven

Dalším krokem po izolaci je příprava takzvaných WGS (Whole Genome Sequencing) knihoven. Ta probíhá v metodě Illumina DNA PCR-Free Library Prep-Tagmentation tak, že se vyizolovaná DNA štěpí enzymaticky pomocí transpozázy. Tato enzymatická fragmentace probíhá současně s připojením adaptérů. To znamená, že během jednoho kroku dojde k rozštěpení DNA na menší fragmenty a k připojení adaptérů na jejich konce. Tento proces se nazývá tagmentace.

Adaptér je krátká syntetická sekvence DNA, která se připojuje ke koncům fragmentované DNA. Slouží k tomu, aby fragmenty DNA mohly být správně amplifikovány, přichycené k flow cell (sekvenačnímu čipu) a přečteny během sekvenace.

Funkce adaptérů v sekvenační knihovně:

1. Přichycení k flow cell – Adaptéry obsahují specifické sekvence, které se vážou k povrchu sekvenačního čipu (flow cell) během sekvenace na platformách Illumina.

2. Amplifikace – Obsahují primovací sekvence, které umožňují PCR amplifikaci knihovny v případě PCR-based protokolů (v případě PCR-free knihoven k amplifikaci nedochází).

3. Indexování (barcoding) – Často obsahují unikátní sekvence tzv. indexy (krátké unikátní sekvence DNA, např. 8–12 bází dlouhé), které umožňují přiřadit fragmenty DNA k určitému vzorku při multiplexním sekvenování (kdy se více vzorků sekvenuje najednou, což snižuje čas a náklady na analýzu). Sekvenování probíhá standardně, ale software zároveň čte i indexové sekvence. Po sekvenaci se softwarem provede „demultiplexing“, což znamená rozdělení přečtených dat zpět na jednotlivé vzorky podle jejich indexů.
   
   

   Open

   

Proč se ale DNA rozděluje na menší části?   

• Prvním důvodem  je, že mnoho sekvenačních přístrojů je nastaveno pro analýzu kratších úseků a při čtení delších úseků DNA by mohlo dojít k chybě a nepřesnostem. Když se DNA rozdělí na menší části, tak se zvyšuje pravděpodobnost, že bude každá část správně přečtena a také se snadněji detekují a opravují případné chyby.

• Dalším důvodem rozdělování DNA na menší části je možnost sekvenovat větší část fragmentů současně, což zrychluje celý proces a zvyšuje množství získaných dat. Celkově tedy rozdělení DNA na menší části zlepšuje efektivitu, přesnost a rychlost sekvenace, což je důležité pro následnou analýzu dat.

Presekvenace

Open

Poté, co jsou připravené WGS knihovny, proběhne ještě tzv. pre-sekvenace vzorků DNA, které byly dodány ze slin. Vzorky slin obvykle obsahují nejen lidské DNA z bílých krvinek, ale také DNA z bakterií, které se v ústech vyskytují. Při zánětu v ústech je bakteriální znečištění obvykle vysoké. Pre-sekvenace pomáhá určit úroveň bakteriálního znečištění a tím určit o kolik více je nutné konkrétní vzorek sekvenovat abychom dosáhli požadovaného množství lidské DNA. Bakteriální znečištění DNA u slin zdravého člověka je cca 1-20%. V průměru je tedy u vzorku slin potřeba sekvenovat DNA více. DNA, které nepatří člověku je později v procesu vyřazeno. Presekvenace je důležitá také pro ověření správnosti přípravy knihovny i u vzorků krve a pomáhá určit výtěžnost.

Jinými slovy, pre-sekvenace je proces, kdy již sekvenujeme, ale kratší dobu menšího množství DNA.

Sekvenace

Následným krokem už je samotná sekvenace DNA pomocí přístroje NovaSeq X Plus. Naším cílem je během sekvenace získat a analyzovat 800 milionů párů DNA fragmentů z krve a 925 milionů fragmentů ze slin, včetně 15% bakteriální kontaminace. Tyto fragmenty DNA v bioinformatice nazýváme READ, který je dlouhý cca 150 bází. Párové čtení se dělá tak, že se sekvenují dva fragmenty DNA z obou konců. To znamená, že pro každý fragment DNA jsou získána dvě sekvenční data, jedno z každého konce. Tato metoda zlepšuje přesnost a usnadňuje rekonstrukci genomu. Cíl 800 milionů párových čtení znamená 800 milionů fragmentů, přičemž každý fragment je sekvenován z obou konců (tedy skutečně 1,6 miliardy individuálních sekvenčních „readů“). Vysoký počet párových čtení je důležitý pro dosažení kvalitního pokrytí celého genomu. To znamená, že každá část genomu je sekvenována vícekrát, což snižuje pravděpodobnost chyb a zvyšuje přesnost analýzy. Naším cílem je dosažení sekvenování DNA takového pokrytí, že každá báze je přečtena v průměru 30 krát. Kromě přečtení hodnoty báze A,T,C nebo G sekvenovací přístroj také pro každou bázi udává i míru jistoty s jakou si je jistý, že se jedná o příslušnou bázi (takzvaný base calling). To nám umožňuje později některé fragmenty vyřadit pro jejich možnou neprůkaznost. Vysoké pokrytí je důležité proto abychom mohli s nejvyšší možnou mírou jistoty prohlásit, že na daném místě se skutečně vyskytuje mutace. Je nutné mít na paměti, že na daném místě ve vaší DNA můžete mít různé báze od každého z rodičů.

Předání dat

Poté, co dojde k dokončení sekvenace v laboratoři, dostaneme do 3 dnů informaci, že máme data k dispozici na speciálním zabezpečeném úložišti, kde si je stáhneme a zahájíme analýzu - pokračování ve článku “Jak provádíme vyhodnocení DNA”. Laboratoř si vzorky, data i data derivovaná neuchovává a maže je po potvrzení přijetí naší stranou.

Diagram

Schéma na obrázku popisuje procesy a místa - od nákupu odběrové sady, odebrání biologického vzorku v pohodlí domova a jeho odevzdání, po převoz do laboratoře, kde vzorek zpracuje. Data ze sekvenace jsou zpracována pomocí software, který nazýváme DNAmeter Procesor. Výstupem jsou relevantní data, které zkontroluje odborník - lékař se specializací lékařská genetika. Po jeho kontrole a vložení příslušných doporučení (např. nutnost podstoupit další vyšetření) jsou data ve formátu lékařské zprávy předána klientovi.

Další články týkající se vašeho vzorku a jeho zpracování