Sekvenace DNA je proces, jehož cílem je určovat pořadí nukleotidů(také nazývaných báze) v DNA molekule.
Nukleotidy jsou základní stavební jednotky DNA, které se skládají ze čtyř typů: adenin Adenin (A), thymin Thymin (T), cytosin Cytosin (C) a guanin Guanin (G). Viz. článek o DNA. Sekvenace Proces sekvenace DNA nám umožňuje číst genetickou informaci obsaženou v DNA a získávat cenné poznatky o genech, genetických variantách a jejich funkcích.
Představte si DNA jako knihu(kuchařku), která určuje, jak má naše tělo růst, fungovat atd. Tato kniha je ale psaná pouze čtyřmi písmeny A, C, T a G a T a při sekvenaci DNA dochází ke čtení písmena po písmenu. Sekvenační stroj v laboratoři rozluští pořadí jednotlivých písmen – sekvenci – což pomáhá pochopit, jak naše tělo funguje, nebo jestli není někde nějaká chyba.
Existuje několik způsobů, jak onu „knihu“ DNA přečíst
...
1. Sangerovo sekvenování
Nejstarší metoda při které se DNA rozdělí na menší kousky, které se pak jeden po druhém přečtou. Je to v podstatě jako číst knihu po větách.
Tuto techniku poprvé vyvinul Frederick Sanger v roce 1977 a následně za ní dostal v roce 1980 Nobelovu cenu.
Princip Sangerova sekvenování spočívá v používání dideoxynukleotidů (ddNTP), které zastavují proces syntézy DNA při jejich zařazení do rostoucího řetězce.
Postup metody
...
Nejprve se vezme zkoumaný vzorek DNA, který se rozdělí na jednotlivé kratší řetězce. Do reakce přidáme speciální „blokátory“ nazývané dideoxynukleotidy (ddNTP). Těmto modifikovaným bázím (blokátorům) chybí -OH skupina na 3' uhlíku deoxyribózy, skupina zodpovědná za fosfodiesterové vazby mezi dvěma nukleotidy, což přeruší syntézu DNA po přidání ddNTP k řetězci. Modifikované báze mohou být
radioaktivně, nebo fluorescentně označeny pro jejich snazší detekci v sekvenačních strojích. Tyto ddNTP se začleňují na náhodná místa řetězce a tak ukončují reakci za vzniku různě dlouhých fragmentů. Analýzou pomocí speciální metody poté seřadíme jednotlivé fragmenty podle délky, takže koncové nukleotidy postupně se prodlužujících fragmentů, vytvoří celistvou řadu. Nakonec se na fragmenty podíváme a pomocí speciálních značek zjistíme, které nukleotidy (A, T, C, G) se na kterém místě nacházejí.
2. Sekvenace
...
druhé generace (NGS)
...
Tato metoda NGS (next generation) funguje tak, jako by danou knihu četlo několik lidí najednou po
...
krátkých částech(cca 150 bází). Je to výrazně rychlejší metoda, než Sangerova, protože umožňuje vysokou míru parelelizace, kdy se čte najednou více
...
částí DNA. Nevýhodou je, že se po sekvenaci musí jednotlivé malé části informace zase složit jako do jedné dlouhé informace. Tato fáze skládání je svým způsobem varianta hry puzzle.
DNAmeter používá tuto metodu.
3. Sekvenace třetí generace
...
Tato metoda čtení DNA je založena na principu změny elektrického pole při průchodu molekuly DNA elektromagnetickým polem nanopóru. Tato metoda taktéž vyžaduje rozdělení DNA na menší fragmenty avšak umožňuje mnohem číst mnohem delší fragmenty při jediném průchodu od 2000-1M bází. Je to jako když čteme knihu řádek po řádku, od začátku do konce, bez nutnosti rozdělit ji na menší části.
...
Tato metoda nám umožňuje odhalit i malé chyby v textu, které by nemuseli být odhaleny z důvodu zkládání krátkých částí při následném sestavování.
Sekvenovat
...
...
.