...
Nejstarší metoda při které se DNA rozdělí na menší kousky, které se pak jeden po druhém přečtou. Je to v podstatě jako číst knihu po větách.
Tuto techniku poprvé vyvinul Frederick Sanger v roce 1977 a následně za ní dostal v roce 1980 Nobelovu cenu.
Princip Sangerova sekvenování spočívá v používání dideoxynukleotidů (ddNTP), které zastavují proces syntézy DNA při jejich zařazení do rostoucího řetězce.
Postup metody
...
Nejprve se vezme zkoumaný vzorek DNA, který se rozdělí na jednotlivé kratší řetězce. Do reakce přidáme speciální „blokátory“ nazývané dideoxynukleotidy (ddNTP). Těmto modifikovaným bázím (blokátorům) chybí -OH skupina na 3' uhlíku deoxyribózy, skupina zodpovědná za fosfodiesterové vazby mezi dvěma nukleotidy, což přeruší syntézu DNA po přidání ddNTP k řetězci. Modifikované báze mohou být
radioaktivně, nebo fluorescentně označeny pro jejich snazší detekci v sekvenačních strojích. Tyto ddNTP se začleňují na náhodná místa řetězce a tak ukončují reakci za vzniku různě dlouhých fragmentů. Analýzou pomocí speciální metody poté seřadíme jednotlivé fragmenty podle délky, takže koncové nukleotidy postupně se prodlužujících fragmentů, vytvoří celistvou řadu. Nakonec se na fragmenty podíváme a pomocí speciálních značek zjistíme, které nukleotidy (A, T, C, G) se na kterém místě nacházejí.
2. Sekvenace druhé generace (NGS)
...