...
Dalším krokem po izolaci je příprava takzvaných WGS (Whole Genome Sequencing) knihoven. Ta probíhá v metodě Illumina DNA PCR-Free Library Prep-Tagmentation tak, že se vyizolovaná DNA rozdělí pomocí přístrojů na menší části. Na konci každé části se připojí koncovka značená ddG, ddA, ddT nebo ddC, kde značka “dd” značí speciálně upravenou molekulu, která zabrání tomu, aby se připojilo další „písmeno“ v řetězu DNA (viz. obrázek 1). Jinými slovy, když se v procesu sekvenace dostaneme k oné speciální molekule značené např. ddG, stavba DNA řetězce se v tomto místě zastavíštěpí enzymaticky pomocí transpozázy. Tato enzymatická fragmentace probíhá současně s připojením adaptérů. To znamená, že během jednoho kroku dojde k rozštěpení DNA na menší fragmenty a k připojení adaptérů na jejich konce. Tento proces se nazývá tagmentace.
Adaptér je krátká syntetická sekvence DNA, která se připojuje ke koncům fragmentované DNA. Slouží k tomu, aby fragmenty DNA mohly být správně amplifikovány, přichycené k flow cell (sekvenačnímu čipu) a přečteny během sekvenace.
Funkce adaptérů v sekvenační knihovně:
Přichycení k flow cell – Adaptéry obsahují specifické sekvence, které se vážou k povrchu sekvenačního čipu (flow cell) během sekvenace na platformách Illumina.
Amplifikace – Obsahují primovací sekvence, které umožňují PCR amplifikaci knihovny v případě PCR-based protokolů (v případě PCR-free knihoven k amplifikaci nedochází).
Indexování (barcoding) – Často obsahují unikátní sekvence tzv. indexy, které umožňují přiřadit fragmenty DNA k určitému vzorku při multiplexním sekvenování (kdy se více vzorků sekvenuje najednou).
Proč se ale DNA rozděluje na menší části?
...
Následným krokem už je samotná sekvenace DNA pomocí přístroje NovaSeq X Plus. Naším cílem je během sekvenace získat a analyzovat 800 milionů párů DNA fragmentů z krve a 925 milionů fragmentů ze slin, včetně 15% bakteriální kontaminace. Tyto fragmenty DNA v bioinformatice nazýváme READ, který je dlouhý cca 150 bází. Párové čtení se dělá tak, že se sekvenují dva fragmenty DNA z obou konců. To znamená, že pro každý fragment DNA jsou získána dvě sekvenční data, jedno z každého konce. Tato metoda zlepšuje přesnost a usnadňuje rekonstrukci genomu. Cíl 800 M milionů párových čtení znamená , že se snažíme získat celkem 800 milionů těchto dvojic800 milionů fragmentů, přičemž každý fragment je sekvenován z obou konců (tedy skutečně 1,6 miliardy individuálních sekvenčních „readů“). Vysoký počet párových čtení je důležitý pro dosažení kvalitního pokrytí celého genomu. To znamená, že každá část genomu je sekvenována vícekrát, což snižuje pravděpodobnost chyb a zvyšuje přesnost analýzy. Naším cílem je dosažení sekvenování DNA takového pokrytí, že každá báze je přečtena v průměru 30 krát. Kromě přečtení hodnoty báze A,T,C nebo G sekvenovací přístroj také pro každou bázi udává i míru jistoty s jakou si je jistý, že se jedná o příslušnou bázi (takzvaný base calling). To nám umožňuje později některé fragmenty vyřadit pro jejich možnou neprůkaznost. Vysoké pokrytí je důležité proto abychom mohli s nejvyšší možnou mírou jistoty prohlásit, že na daném místě se skutečně vyskytuje mutace. Je nutné mít na paměti, že na daném místě ve vaší DNA můžete mít různé báze od každého z rodičů.
...