...
Dalším krokem po izolaci je příprava takzvaných WGS (Whole Genome Sequencing) knihoven. Ta probíhá v metodě Illumina DNA PCR-Free Library Prep-Tagmentation tak, že se vyizolovaná DNA štěpí enzymaticky pomocí transpozázy. Tato enzymatická fragmentace probíhá současně s připojením adaptérů. To znamená, že během jednoho kroku dojde k rozštěpení DNA na menší fragmenty a k připojení adaptérů na jejich konce. Tento proces se nazývá tagmentace.
Adaptér je krátká syntetická sekvence DNA, která se připojuje ke koncům fragmentované DNA. Slouží k tomu, aby fragmenty DNA mohly být správně amplifikovány, přichycené k flow cell (sekvenačnímu čipu) a přečteny během sekvenace.
Funkce adaptérů v sekvenační knihovně:
Přichycení k flow cell – Adaptéry obsahují specifické sekvence, které se vážou k povrchu sekvenačního čipu (flow cell) během sekvenace na platformách Illumina.
Amplifikace – Obsahují primovací sekvence, které umožňují PCR amplifikaci knihovny v případě PCR-based protokolů (v případě PCR-free knihoven k amplifikaci nedochází).
Indexování (barcoding) – Často obsahují unikátní sekvence tzv. indexy (krátké unikátní sekvence DNA, např. 8–12 bází dlouhé), které umožňují přiřadit fragmenty DNA k určitému vzorku při multiplexním sekvenování (kdy se více vzorků sekvenuje najednou, což snižuje čas a náklady na analýzu). Sekvenování probíhá standardně, ale software zároveň čte i indexové sekvence. Po sekvenaci se softwarem provede „demultiplexing“, což znamená rozdělení přečtených dat zpět na jednotlivé vzorky podle jejich indexů.
...